同型对照抗体 | 在体内实验中如何选择和使用？

前言

在肿瘤免疫、自身免疫疾病研究以及抗体药物的临床前开发中，体内实验（In Vivo）是验证药物疗效和机制的关键基石。然而，活体动物体内复杂的免疫微环境常常会给实验带来各种非特异性的“噪音”。

为了确保实验结果的真实性与可重复性，同型对照抗体（Isotype Control）成为了体内实验中不可或缺的对照工具。本文将从四个核心角度，带您全面了解如何科学地选择和使用同型对照抗体。

一、同型对照抗体是什么？

同型对照抗体是一种与实验抗体在宿主物种、免疫球蛋白类型和亚型上完全匹配，但不针对目标抗原的特异性结合的阴性对照抗体。

• 核心特点：保留实验抗体的Fc区结构、分子量和可能的非特异性结合能力（如Fc受体结合），但变量区无特异性。

• 常见形式：重组单克隆抗体，可为无标记、荧光标记或带Fc突变（如LALAPG、D265A等Fc silent版本）。

• 作用：作为“镜像对照”，排除背景信号，凸显目标抗体的真实生物学效应。

简单比喻：实验抗体是“特异侦探”；同型对照是“外貌相同但无目标的替身”，用于排除假信号。

图 1. IgM的结构示意图[1]

二、体内实验为什么要使用同型对照抗体？

体内实验（如小鼠肿瘤模型）环境复杂，抗体除Fab区特异性结合外，还可能通过Fc区与免疫细胞FcγR结合，引发非特异性炎症、细胞激活或清除等效应。

• PBS或空白对照的局限：无法模拟抗体的Fc介导效应，可能导致肿瘤生长抑制（TGI）计算偏差，高估或低估疗效。

• 同型对照的优势：准确隔离非特异性背景（Fc结合、内毒素诱导炎症等），确保实验组与对照组条件一致，提升数据可信度。

• 典型场景：在MC38、4T1等肿瘤模型中，同型对照抗体被用来比较抗小鼠PD-1单抗（RMP1-14）、抗小鼠PD-L1单抗（10F.9G2）等功能抗体与对照的肿瘤抑制、生存期和免疫浸润差异。

关键结论：体内实验推荐使用同型对照，而非仅用PBS，以避免结果被质疑。

图 2. 小鼠体内肿瘤模型分类示意图[2]

三、体内实验 | 关于同型对照抗体的常见问题

• Q1：体内实验一定要设置同型对照组吗？
• A1：不一定所有实验都必须设置，但在动物体内实验中，尤其是免疫调节、阻断、中和、激活、细胞清除和肿瘤免疫实验中，同型对照通常是非常重要的阴性对照。

• Q2：可以用 PBS 代替同型对照抗体吗？
• A2：通常不建议简单替代。PBS 可以控制注射操作、缓冲液和给药体积的影响，但不能控制抗体蛋白本身、Fc 受体结合、补体激活、IgG 分布和抗体负荷带来的影响。如果实验组使用的是体内功能性抗体，同型对照抗体比 PBS 更能模拟“给动物注射一支不针对靶点的同类型抗体”的背景。

• Q3：普通流式用同型对照抗体可以用于动物体内注射吗？
• A3：不建议。普通流式、免疫荧光或免疫组化用同型对照抗体可能含有叠氮化钠、BSA或其他防腐剂、稳定剂和载体蛋白，也可能没有经过体内使用所需的内毒素控制或无菌过滤。体内实验应优先选择低内毒素、不含稳定剂、防腐剂、载体蛋白、甘油或任何其他添加剂的同型对照抗体。

• Q4：同型对照抗体的剂量应该怎么设置？
• A4：通常建议与实验抗体保持一致。如果实验抗体使用 200 μg/mouse，同型对照抗体也建议使用 200 μg/mouse。如果实验抗体按照 10 mg/kg 给药，同型对照抗体也应按照 10 mg/kg 给药。这样可以尽量保证两组动物接受相同的抗体蛋白负荷和相同的 Fc 背景。

• Q5：为什么选择 Syd Labs 同型对照抗体？
• A5：Syd Labs 提供各类品种的同型对照抗体，适用于体内和体外研究。我们的体内实验级重组同型对照抗体具有多重优势：

• • 重组生产工艺： Syd Labs生产的体内实验级重组同型对照抗体采用抗体药物生产中常用的化学成分确定的培养基和CHO细胞，没有来自小鼠腹水和细胞培养基里FBS的抗体污染，同时也没有杂交瘤天然的批次之间的不稳定性。

  • 自由工程改造： Syd Labs生产的体内实验级重组同型对照抗体还可以进行自由工程改造，包括切换isotype、Fc突变、提升亲和力和产量、人源化或小鼠源化以降低免疫原性。别的品牌可能也提供重组版的同型对照抗体，但是其价格比Syd Labs的同型对照高很多，而且品种远没有Syd Labs同型对照多，给客户的选择就少。

  • 低内毒素水平：Syd Labs 体内实验级重组同型对照抗体的内毒素一般<1.0 EU/mg (<0.001 EU/μg) ，满足动物实验注射溶液低内毒素的要求。根据客户的定制要求，其内毒素可低至0.05 EU/mg（FDA对临床产品的质量要求），属于当前科研抗体内毒素水平的天花板。同时其价格在同等内毒素标准下价格比同行用杂交瘤生产的抗体价格低20%到50%。

  • 高纯度保证： 纯度>95%（由SDS-PAGE测定），无防腐剂、无载体蛋白，是体内注射的优质选择。

四、同型对照抗体在体内实验中如何选择？

同型对照抗体选择的核心标准是最大化匹配实验抗体，同时满足体内实验的质量要求：

• 匹配原则（优先级）：
  1. 种属一致：Mouse、Rat、Human。
  2. 亚型一致：IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgG4 S228P。
  3. 亚链一致：kappa、lambda。
  4. 推荐重组单克隆抗体，剂量/给药方案与实验抗体保持一致。
  5. Fc突变形式保持一致：实验抗体为了消除效应功能而对 Fc 段进行了突变改造（如引入了 LALAPG 或 D265A 突变），其同型对照也必须选择带有相同 Fc 突变形式的重组对照抗体，否则对照组的 Fc 活性将显著高于实验组，导致背景对照失效。

• 普通体外检测（如流式、ELISA）级别的抗体绝对不能用于体内注射。体内实验级别的同型对照抗体必须满足以下质量要求：
  1. 低内毒素：内毒素是体内实验的“隐形杀手”。高内毒素会直接刺激小鼠产生非特异性炎症（如激活 TLR4 途径），掩盖或干扰药物的真实疗效。动物实验注射溶液要求低内毒素，内毒素必须< 1.0 EU/mg。
  2. 无防腐剂：必须确保不含叠氮化钠或高浓度 BSA。叠氮化钠对活体动物具有剧毒。
  3. 高纯度：纯度 >95%，确保制剂无高分子聚集体，避免触发体内非特异性栓塞或免疫复合物清除。

同型对照抗体必须与一抗的反应物种（种属来源/宿主物种）、同种型和亚类相匹配。 下表展示了Syd Labs 体内实验级重组同型对照抗体部分产品的相关信息（以下为产品简称，全称均带有”In Vivo Grade Recombinant”字样，均为重组抗体，纯度>95% ，内毒素<1 EU/mg，适用于体内和体外研究）。

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参考资料

[1]  Gong S, Ruprecht RM. Immunoglobulin M: An Ancient Antiviral Weapon – Rediscovered. Front Immunol. 2020 Aug 11;11:1943. doi: 10.3389/fimmu.2020.01943. PMID: 32849652; PMCID: PMC7432194.

[2]  De Vleeschauwer S I, van de Ven M, Oudin A, et al. OBSERVE: guidelines for the refinement of rodent cancer models[J]. Nature Protocols, 2024, 19(9): 2571-2596.

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